Inhibitory Killer Immunoglobulin-like receptors to self HLA-B and HLA-C ligands contribute differentially to Natural Killer cell functional potential in HIV infected Slow Progressors

Ce manuscrit est une pré-publication d'un article paru dans Clinical Immunology 2012; 143(3): 246-255 url: http://www.journals.elsevier.com/clinical-immunology/

The anti-inflammatory properties of intravenous immunoglobulin in a murine model of allergic airway disease ; effects on the development of regulatory T-cells

Les immunoglobulines intraveineuses (IVIg) constituent une préparation polyclonale d’IgG isolée et regroupée à partir du plasma sanguin de multiples donneurs. Initialement utilisé comme traitement de remplacement chez les patients souffrant d’immunodéficience primaire ou secondaire, les IVIg sont maintenant largement utilisées dans le traitement de plusieurs conditions auto-immunes, allergiques ou inflammatoires à une dose élevée, dite immunomodulatrice. Différents mécanismes d’action ont été postulés au fil des années pour expliquer l’effet thérapeutique des IVIg dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Entre autre, un nombre grandissant de données issues de modèles expérimentaux chez l’animal et l’humain suggère que les IVIg induisent l’expansion et augmentent l’action suppressive des cellules T régulatrices (Tregs), par un mécanisme qui demeure encore inconnu. Également, les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires présentent souvent un nombre abaissé de Tregs par rapport aux individus sains. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les IVIg modulent les cellules T régulatrices est requise afin de permettre un usage plus rationnel de ce produit sanguin en tant qu’alternative thérapeutique dans le traitement des maladies auto-immunes et inflammatoires. Par le biais d’un modèle expérimental d’allergie respiratoire induite par un allergène, nous avons démontré que les IVIg diminuaient significativement l’inflammation au niveau des voies aériennes ce, en association avec une différenciation des Tregs à partir des cellules T non régulatrices du tissu pulmonaire. Nous avons également démontré qu’au sein de notre modèle expérimental, l’effet anti-inflammatoire des IVIg était dépendant des cellules dendritiques CD11c+ (CDs) pulmonaires, puisque cet effet pouvait être complètement reproduit par le transfert adoptif de CDs provenant de souris préalablement traitées par les IVIg. À cet effet, il est déjà établi que les IVIg peuvent moduler l’activation et les propriétés des CDs pour favoriser la tolérance immunitaire et que ces cellules seraient cruciales pour l’induction périphérique des Tregs. C’est pourquoi, nous avons cherché à mieux comprendre comment les IVIg exercent leur effet sur ces cellules. Pour la première fois, nous avons démontré que la fraction d’IgG riche en acide sialique (SA-IVIg) (constituant 2-5% de l’ensemble des IgG des donneurs) interagit avec un récepteur dendritique inhibiteur de type lectine C (DCIR) et active une cascade de signalement intracellulaire initiée par la phosphorylation du motif ITIM qui est responsable des changements observés en faveur de la tolérance immunitaire auprès des cellules dendritiques et des Tregs. L’activité anti-inflammatoire de la composante SA-IVIg a déjà été décrite dans des études antérieures, mais encore une fois le mécanisme par lequel ce traitement modifie la fonction des CDs n’a pas été établi. Nous avons finalement démontré que le récepteur DCIR facilite l’internalisation des molécules d’IgG liées au récepteur et que cette étape est cruciale pour permettre l’induction périphérique des Tregs. En tant que produit sanguin, les IVIg constitue un traitement précieux qui existe en quantité limitée. La caractérisation des mécanismes d’action des IVIg permettra une meilleure utilisation de ce traitement dans un vaste éventail de pathologies auto-immunes et inflammatoires.

Active nuclear import and cytoplasmic retention of activation-induced deaminase

The enzyme activation-induced deaminase (AID) triggers antibody diversification in B cells by catalyzing deamination and consequently mutation of immunoglobulin genes. To minimize off-target deamination, AID is restrained by several regulatory mechanisms including nuclear exclusion, thought to be mediated exclusively by active nuclear export. Here we identify two other mechanisms involved in controlling AID subcellular localization. AID is unable to passively diffuse into the nucleus, despite its small size, and its nuclear entry requires active import mediated by a conformational nuclear localization signal. We also identify in its C terminus a determinant for AID cytoplasmic retention, which hampers diffusion to the nucleus, competes with nuclear import and is crucial for maintaining the predominantly cytoplasmic localization of AID in steady-state conditions. Blocking nuclear import alters the balance between these processes in favor of cytoplasmic retention, resulting in reduced isotype class switching.

Innate immunity genes as determinants of resistance/susceptibility to human disease : studies in leukemia patients

La leucémie lymphoblastique aiguë des cellules Pré-B (B-ALL) reste le type de cancer le plus souvent diagnostiqué chez les enfants. Des études ont montré que des déterminants génétiques jouent un rôle important dans la susceptibilité/résistance au développement de ce cancer. À cet égard, les gènes Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor (KIR) sont d'une importance particulière. Ces gènes sont fortement polymorphiques et codent pour des récepteurs qui contrôlent l’activité fonctionnelle des cellules Natural Killer (NK). Notre hypothèse est que les gènes activateurs des KIR s’associent avec la résistance innée pour développer la B-ALL. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons entrepris une étude de cas-contrôles chez des enfants canadiens-français dans laquelle nous avons utilisé l'ADN génomique de 100 patients atteints de B-ALL ainsi que l’ADN de 245 individus sains. La présence ou l'absence de chaque gène KIR a été détectée par PCR en utilisant des amorces de séquences spécifiques. Nous avons trouvé que la présence des gènes KIR activateurs est significativement diminuée chez les enfants leucémiques par rapport aux témoins. En outre, le nombre de ces gènes a aussi montré une association significative linéaire avec la résistance au développement d’une B-ALL. Cela suggère des effets additifs de ces gènes permettant de conférer une protection contre ce cancer. Ces résultats pourraient être utiles afin de déceler de façon précoce les enfants ayant un risque de développer cette leucémie. Enfin, des stratégies thérapeutiques basées sur les récepteurs KIR pourraient être envisagées et s'avérer utiles concernant le traitement de ce cancer chez les enfants.

Pathogenèse de l’hépatite autoimmune : influence des gènes, du sexe, de l’âge et de l’environnement

L’hépatite autoimmune (HAI) résulte d’une perte de tolérance du système immunitaire envers des antigènes de l’hépatocyte. Elle peut se présenter sous forme d’hépatite aiguë, parfois fulminante, ou comme une maladie chronique menant progressivement à une cirrhose hépatique. En absence de traitement, cette maladie est fatale. La pathogenèse de l’HAI et les mécanismes responsables de sa progression restent inconnus à ce jour. L’objectif global de ce projet est d’examiner les facteurs prédisposants et les mécanismes immunologiques responsables de l’apparition et de la progression de l’HAI. Pour permettre l’étude de la pathogenèse de l’HAI, nous avons développé un modèle murin expérimental d’hépatite autoimmune de type 2. Celui-ci est basé sur la xénoimmunisation de souris C57BL/6 avec les deux antigènes ciblés dans l’HAI de type 2 chez l’homme (CYP2D6 et FTCD). Par mimétisme moléculaire, le système immunitaire de ces souris réagit contre les protéines murines homologues et une HAI s’ensuit. Ce modèle expérimental présente la plupart des caractéristiques histologiques, biochimiques et sérologiques d’une HAI de type 2. Les souris développent une inflammation autoimmune chronique avec présence d’hépatite d’interface et d’infiltrations intralobulaires, un infiltrat composé majoritairement de lymphocytes T CD4+ mais aussi de lymphocytes T CD8+ et B, d’une élévation des ALT sériques, des niveaux d’immunoglobulines G circulantes augmentés ainsi que d’autoanticorps anti-LKM1 et anti-LC1. L’étude de l’influence du bagage génétique a permis de définir l’importance relative des gènes du CMH et des gènes non-CMH sur le développement d’une HAI. Les gènes du locus CMH sont essentiels mais insuffisants pour mener au développement d’une HAI et donc, la susceptibilité génétique à l’HAI est comme chez l’homme, multigénique. Les patients atteints d’HAI de type 2 sont généralement des jeunes filles. L’étude des influences de l’âge et du sexe dans ce modèle a permis de montrer que les souris femelles avant et au début de leur maturité sexuelle sont plus susceptibles au développement d’une HAI de type 2. De plus, les femelles ont un nombre réduit de lymphocytes T régulateurs, ce qui leur confère une susceptibilité accrue comparé aux mâles. L’ensemble de ces travaux nous a conduits à proposer un mécanisme où le développement d’une HAI chez les femelles d’un âge particulier résulterait de l’activation de cellules T CD4+ autoréactives ayant échappé aux mécanismes de tolérance centrale, via un mécanisme de mimétisme moléculaire avec un antigène exogène. En présence d’une tolérance périphérique réduite due à un faible nombre de cellules T régulatrices, les cellules T autoréactives proliféreraient et activeraient des cellules B autoréactives entraînant la sécrétion d’autoanticorps. L’activation subséquente de cellules T CD8+ cytotoxiques spécifiques amènerait la lyse des hépatocytes et la relâche d’autoantigènes permettant la perpétuation de l’autoimmunité.

Rôle de l'axe CD40/CD40L dans la régulation de la fonction paquettaire

Le CD40 ligand (CD40L) est une molécule inflammatoire appartenant à la famille du Facteur de Nécrose Tumorale ("Tumor Necrosis Factor", TNF), originalement identifié au niveau des cellules immunitaires. L’interaction du CD40L avec son récepteur de haute affinité présent sur les cellules B, le CD40, est d’une importance cruciale à la production d’immunoglobulines lors de la réponse immunitaire. Aujourd’hui, nous savons que ces deux molécules qui constituent l’axe CD40/CD40L sont aussi exprimées au niveau des cellules du système vasculaire et occupent une place importante dans une variété de réactions inflammatoires, de sorte que le CD40L est présentement reconnu comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des évènements cardiovasculaires. Les plaquettes sont la principale source du CD40L soluble ("soluble CD40L", sCD40L) plasmatique et il fut démontré être impliqué dans l’activation plaquettaire, malgré que son impact exact sur la fonction plaquettaire et les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Ainsi, le but de ce projet était de déterminer l’impact du sCD40L sur la fonction plaquettaire et d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Les objectifs spécifiques étaient : 1) d’évaluer l’impact du sCD40L sur l’activation et l’agrégation plaquettaire in vitro; 2) de déterminer le récepteur cible (CD40 ou autre) impliqué dans ces effets; 3) de décortiquer les voies signalétiques intracellulaires et moléculaires induites par le sCD40L, impliquant la participation potentielle de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor", TRAF) et 4) d’analyser l’effet du sCD40L sur la formation du thrombus in vivo. Le sCD40L augmente fortement l’activation et l’agrégation plaquettaire induite par de faibles doses d’agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n’interagit pas avec le CD40 et les plaquettes de souris CD40 déficientes (CD40-/-) ne furent pas en mesure d’induire ces effets. De plus, nous démontrons la présence de plusieurs membres de la famille des TRAFs dans les plaquettes, parmi lesquels seulement TRAF-2 interagit avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Le sCD40L agit sur les plaquettes au repos par l’entremise de la protéine Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase activatrice du mitogène p38 ("Mitogen Activating Protein Kinase", MAPK). Ceci mène ultimement au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l’actine. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les souris CD40-/- démontrent un défaut significatif de l’agrégation plaquettaire en réponse au collagène, ce qui souligne l’importance du CD40 dans les interactions plaquettes-plaquettes. Dans un deuxième temps, le sCD40L amplifie l’agrégation plaquettaire en sang complet, accélère les temps de thrombose in vitro mesurés à l’aide du système PFA-100 et augmente l’adhésion plaquettaire au collagène sous condition de flux, le tout par l’entremise du CD40. Finalement, dans un modèle de thrombose artérielle murin, l’infusion du sCD40L exacerbe la formation du thrombus chez les souris du type sauvage ("Wild Type", WT), mais non chez les souris CD40-/-. Ceci fut en plus associé à une augmentation significative du nombre de leucocytes au sein du thrombus des souris WT traitées à l’aide du sCD40L, tel que démontré par marquage immuno-histologique anti-CD45 et par quantification des coupes artérielles par microscopie optique. En résumé, ce projet identifie une nouvelle voie signalétique, TRAF-2/Rac1/p38 MAPK, en réponse au sCD40L et démontre ses effets sur l’activation et l’agrégation plaquettaire. De manière encore plus importante, nous démontrons pour la première fois la présence d’une corrélation positive entre les niveaux circulants du sCD40L et la thrombose artérielle, tout en soulignant l’importance du CD40 dans ce processus. Ainsi, le sCD40L constitue un activateur important des plaquettes, les prédisposant à une thrombose exacerbée en réponse au dommage vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer le lien étroit qui existe entre les niveaux circulants du sCD40L et l’incidence des maladies cardiovasculaires.

Importance of the HSP90 molecular chaperoning pathway for antibody diversification by determining AID stability

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID.

CD40 signalling in platelet function

Le CD40 est un membre de la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale ("Tumour necrosis factor", TNF), initialement identifié sur des cellules de carcinome de la vessie. L'interaction du CD40 avec son ligand (CD40L) est d'une importance cruciale pour le développement des cellules B et de la commutation d'isotype au cours de la réponse immunitaire acquise. L'expression du complexe CD40/CD40L était initialement cru d'être limiter aux cellules du système immunitaire, mais aujourd'hui il est bien connu que ce complexe est également exprimé sur les cellules du système circulatoire et vasculaire, et est impliqué dans diverses réactions inflammatoires; de sorte que le CD40L est maintenant considéré comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des événements cardiovasculaires. Les plaquettes expriment constitutivement le CD40, alors que le CD40L n'est exprimé que suite à leur l'activation. Il est ensuite clivé en sa forme soluble (sCD40L) qui représente la majorité du sCD40L en circulation. Il fut démontré que le sCD40L influence l'activation plaquettaire mais son effet exact sur la fonction plaquettaire, ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à son action demeurent inconnus. Ainsi, ce projet a été entrepris dans le but d’adresser les objectifs spécifiques suivants: 1) évaluer les effets in vitro du sCD40L sur l'activation et l'agrégation plaquettaire; 2) identifier les récepteurs plaquettaires impliqués dans l’action du sCD40L; 3) élucider les voies signalétiques intracellulaires induits par le sCD40L; 4) évaluer les effets du sCD40L sur la formation de thrombus in vivo. Nous avons trouvé que le sCD40L augmente fortement l'activation et l'agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations d'agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n'interagit pas avec le CD40, et les plaquettes de souris déficientes en CD40 ne furent pas en mesure d'induire de telles réponses, indiquant que le récepteur principal du sCD40L au niveau des plaquettes est le CD40. En plus, nous avons identifié la présence de plusieurs membres de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("TNF receptor-associated factor", TRAF) dans les plaquettes et nous avons montré que seulement le TRAF2 s'associe avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Nos résultats indiquent aussi que le sCD40L agisse sur les plaquettes au repos par l'entremise de deux voies signalétiques distinctes. La première voie implique l'activation de la petite GTPase Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase p38 activée par le mitogène ("p38 mitogen-activated protein kinase", p38 MAPK ), menant au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l'actine; alors que la deuxième voie implique l'activation de la cascade signalétique du NF-kB. Par ailleurs, à la suite d'une lésion artérielle induite par le chlorure de fer, le sCD40L exacerbe la formation de thrombus et l'infiltration leucocytaire au sein du thrombus dans les souris du type sauvage, mais pas chez les souris déficientes en CD40. En conclusion, ce projet a permis d'identifier pour la première fois deux voies signalétiques distinctes en aval du CD40 plaquettaire et a permis d'établir leur implication dans l'activation et l'agrégation plaquettaire en réponse au sCD40L. De manière plus importante, ce projet nous a permis d'établir un lien direct entre les niveaux élevés du sCD40L circulant et la formation de thrombus in vivo, tout en soulignant l'importance du CD40 dans ce processus. Par conséquent, l'axe CD40/CD40L joue un rôle important dans l'activation des plaquettes, les prédisposant à une thrombose accrue en réponse à une lésion vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer en partie la corrélation entre les taux circulants élevés du sCD40L et l'incidence des maladies cardiovasculaires.

Le rôle de l’inflammation dans le développement des complications neurologiques associées à l’insuffisance hépatique aiguë chez la souris

L’insuffisance hépatique aiguë (IHA) se caractérise par la perte soudaine de la fonction hépatique résultant de la nécrose massive des hépatocytes en l’absence de pathologie hépatique préexistante. L’IHA s’accompagne de perturbations métaboliques et immunologiques qui peuvent entraîner l’apparition de complications périphériques et cérébrales telles qu’un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS), une encéphalopathie hépatique (EH), un œdème cérébral, une augmentation de la pression intracrânienne, et la mort par herniation du tronc cérébral. Les infections sont une complication fréquente de l’IHA et elles sont associées à un risque accru de développer un SIRS et une aggravation subséquente de l’EH avec un taux de mortalité augmenté. L’ammoniaque joue un rôle majeur dans les mécanismes physiopathologiques qui mènent au développement de l’EH et de l’œdème cérébral, et des études récentes suggèrent que les cytokines pro-inflammatoires sont également impliquées. Le but de cette thèse est d’étudier le rôle des cytokines pro-inflammatoires circulantes et cérébrales dans le développement de l’EH et de l’œdème cérébral lors d’IHA. Dans l’article 1, nous démontrons que l’inhibition périphérique du facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) par l’etanercept retarde la progression de l’EH en diminuant le dommage hépatocellulaire, réduisant l’inflammation périphérique et centrale ainsi que le stress oxydatif/nitrosatif hépatique et cérébral associé chez la souris avec une IHA induite par l’azoxyméthane (AOM). Ces résultats démontrent un rôle important du TNF-α dans la physiopathologie de l’EH lors d’IHA d’origine toxique et suggèrent que l’etanercept pourrait constituer une approche thérapeutique dans la prise en charge des patients en attente de transplantation hépatique. Dans l’article 2, nous simulons la présence d’une infection chez la souris avec une IHA induite par l’AOM pour mettre en évidence une éventuelle augmentation de la réponse inflammatoire. Nous démontrons que l’endotoxémie induite par le lipopolysaccharide (LPS) précipite la survenue du coma et aggrave la pathologie hépatique. Les cytokines pro-inflammatoires systémiques et cérébrales sont augmentées de façon synergique par le LPS lors d’IHA et résultent en une activation accrue de la métalloprotéinase matricielle-9 cérébrale qui s’accompagne d’une extravasation d’immunoglobulines G (IgG) dans le parenchyme cérébral. Ces résultats démontrent une augmentation majeure de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui contribue à la pathogenèse de l’EH lors d’IHA en condition infectieuse. Les résultats de l’article 3 démontrent que l’augmentation de la perméabilité de la BHE lors d’IHA induite par l’AOM en condition non infectieuse ne résulte pas de l’altération de l’expression des protéines constitutives de la BHE. Dans l’article 4, nous démontrons que l’exposition d’astrocytes en culture à des concentrations physiopathologiques d’ammoniaque ou d’interleukine-1β résulte en l’altération de gènes astrocytaires impliqués dans la régulation du volume cellulaire et dans le stress oxydatif/nitrosatif. Un effet additif est observé dans le cas d’un traitement combiné au niveau des gènes astrocytaires impliqués dans le stress oxydatif/nitrosatif. L’ensemble des résultats de cette thèse démontre un rôle important de l’inflammation périphérique et cérébrale dans la survenue des complications neurologiques lors d’IHA et une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués pourrait contribuer à la mise en place de stratégies thérapeutiques chez les patients atteints d’IHA en attente de transplantation.

Étude de l’immunité mucosale génitale chez des femmes béninoises hautement exposées au VIH-1 séronégatives (HESN) et séropositives.

Introduction : Aujourd’hui, 35,3 millions de personnes vivent avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1 dans le monde ; l’Afrique subsaharienne concentre 70% des nouvelles infections et les femmes en représentent plus de la moitié. Le mode de transmission du VIH le plus répandu est par voie mucosale génitale suite à des relations sexuelles. Le tractus génital féminin (TGF) possède un milieu immunitaire complexe qui doit contrer l’invasion par des pathogènes tout en maintenant la tolérance/contrôle de la flore normale vaginale étant sous la pression de procréation sous influence des hormones sexuelles. De plus, les mécanismes favorisant ou prévenant l’infection du TGF par le VIH ne sont pas précisément identifiés. Hypothèse : Le contexte inflammatoire mucosal génital et la résultante de dialogues intercellulaires tel qu’entre les cellules épithéliales génitales (CEG) et les cellules dendritiques myéloïdes (mDC), qui sont des premières à rencontrer le virus aux portes d’entrée mucosales, modulent l’activité des lymphocytes qui est déterminante dans le type de réponse immunitaire élaborée par l’hôte. Méthodologie : Des spécimens provenant d’une cohorte de travailleuses du sexe (TS) recrutées à Cotonou au Bénin en Afrique subsaharienne ont été analysés. Nous avons caractérisé le milieu mucosal génital féminin hautement exposé au VIH de TS séronégatives (highly exposed seronegative; HESN) en comparaison avec celui de TS séropositives. Brièvement, les liquides cervicaux-vaginaux ont été déterminés par des techniques de multiplexes/Luminex ou par ELISA et le milieu cellulaire a été décrit suite à des analyses de cytométrie en flux (phénotypage et tri cellulaire). Résultats : Nous avons observé la présence augmentée d’un facteur soluble antiviral, immunomodulateur et antiprolifératif sécrété dans le TGF des TS HESN qui est l’interféron (IFN)-α. La présence augmentée de cette cytokine suggère l’existence possible de connexions intercellulaires clés qui pourraient mener à une régulation homéostatique du compartiment immunitaire génital permettant de contrôler l’infection par le VIH-1. En étudiant l’expression de molécules impliquées dans les voies de signalisation associées à la production d’IFN-α dans les CEG et les cellules myéloïdes du TGF, nous avons pu mettre en évidence l’existence d’un microenvironnement présentant un profil «tolérogénique/régulateur» dans le TGF des TS HESN. Conclusion : Nos observations nous ont permis d’élucider certaines hypothèses sur un potentiel mécanisme d’immunité naturelle protecteur chez les TS HESN. De plus, nous sommes des premiers à décrire une population myéloïde présentant des caractéristiques de DC «tolérogéniques» de par leur expression d’interleukine (IL)-10, de human leukocyte antigen (HLA)-G et de immunoglobulin-like transcript (ILT)-4 dans le TGF de TS HESN. Cette étude aura des implications majeures dans le développement de stratégies d’interventions préventives afin de moduler des conditions inflammatoires préexistantes ainsi établissant une défense mucosale rapide et durable contre le VIH-1.

Perspectives de l'usage de poudre de jaunes d’oeuf comme additif alimentaire contre Campylobacter jejuni chez le poulet : mode d'immunisation et effet de l’encapsulation

La campylobactériose est une zoonose causée par Campylobacter jejuni, une bactérie commensale du poulet, considérée comme la principale source de contamination humaine. C. jejuni est rarement retrouvé dans le tube digestif des poulets avant deux ou trois semaines d'âge. Ce qui pourrait s'expliquer par la transmission d'une immunité maternelle (anticorps IgY) transmise aux poussins via le jaune d'œuf. À la Chaire de recherche en Salubrité des Viandes (CRSV), la caractérisation d'anticorps IgY extraits de jaunes d'œufs frais a montré des niveaux de production d’anticorps différents selon le mode d’immunisation et suggère, in vitro, des effets sur ce pathogène. Ce qui laisse penser qu'en tant qu'additif alimentaire, une poudre de jaunes d'œuf potentialisée permettrait de lutter contre C. jejuni chez le poulet à griller. Dans ce travail, le processus de fabrication de l'additif (déshydratation par « Spray dry » puis encapsulation) a été évalué et les différents modes d'immunisation des poules pondeuses ont également été comparés. Les anticorps ont été extraits des différentes poudres de jaunes d'œuf ou du produit final encapsulé, et caractérisés in vitro (dosage / ELISA, test de mobilité, bactéricidie, western blot). Puis, une évaluation in vivo de la capacité de ces poudres encapsulées, incorporée à 5 % dans la moulée, afin de réduire ou de bloquer la colonisation intestinale des oiseaux par C. jejuni a été testée. In vitro, les résultats ont montré des concentrations d'anticorps et d'efficacité variables selon le type de vaccination. Dans cette étude, on a observé que le « Spray dry » a concentré les anticorps dans les poudres et que ces anticorps sont restés fonctionnels contre C. jejuni. On a également observé que l'encapsulation n’entraîne pas une perte quantitative des anticorps contenus dans les poudres. Malgré les résultats in vitro encourageants, les résultats in vivo ne révèlent aucune inhibition ou réduction de la colonisation des oiseaux par C. jejuni. L’absence d’efficacité la poudre de jaunes d’œuf encapsulée dans notre étude n’est pas due à une perte quantitative et/ou qualitative des anticorps comme soutenu dans les expériences in vitro. Ce qui démontre que les recherches doivent être poursuivies afin de déterminer les conditions optimales de l'utilisation de la poudre de jaune d'œuf in vivo, en tant qu'additif alimentaire chez les poulets

Co-encapsulation of enzymes and antibodies for chemical deactivation of pathogens on paper

Le papier bioactif est obtenu par la modification de substrat du papier avec des biomolécules et des réactifs. Ce type de papier est utilisé dans le développement de nouveaux biocapteurs qui sont portables, jetables et économiques visant à capturer, détecter et dans certains cas, désactiver les agents pathogènes. Généralement les papiers bioactifs sont fabriqués par l’incorporation de biomolécules telles que les enzymes et les anticorps sur la surface du papier. L’immobilisation de ces biomolécules sur les surfaces solides est largement utilisée pour différentes applications de diagnostic comme dans immunocapteurs et immunoessais mais en raison de la nature sensible des enzymes, leur intégration au papier à grande échelle a rencontré plusieurs difficultés surtout dans les conditions industrielles. Pendant ce temps, les microcapsules sont une plate-forme intéressante pour l’immobilisation des enzymes et aussi assez efficace pour permettre à la fonctionnalisation du papier à grande échelle car le papier peut être facilement recouvert avec une couche de telles microcapsules. Dans cette étude, nous avons développé une plate-forme générique utilisant des microcapsules à base d’alginate qui peuvent être appliquées aux procédés usuels de production de papier bioactif et antibactérien avec la capacité de capturer des pathogènes à sa surface et de les désactiver grâce à la production d’un réactif anti-pathogène. La conception de cette plate-forme antibactérienne est basée sur la production constante de peroxyde d’hydrogène en tant qu’agent antibactérien à l’intérieur des microcapsules d’alginate. Cette production de peroxyde d’hydrogène est obtenue par oxydation du glucose catalysée par la glucose oxydase encapsulée à l’intérieur des billes d’alginate. Les différentes étapes de cette étude comprennent le piégeage de la glucose oxydase à l’intérieur des microcapsules d’alginate, l’activation et le renforcement de la surface des microcapsules par ajout d’une couche supplémentaire de chitosan, la vérification de la possibilité d’immobilisation des anticorps (immunoglobulines G humaine comme une modèle d’anticorps) sur la surface des microcapsules et enfin, l’évaluation des propriétés antibactériennes de cette plate-forme vis-à-vis l’Escherichia coli K-12 (E. coli K-12) en tant qu’un représentant des agents pathogènes. Après avoir effectué chaque étape, certaines mesures et observations ont été faites en utilisant diverses méthodes et techniques analytiques telles que la méthode de Bradford pour dosage des protéines, l’électroanalyse d’oxygène, la microscopie optique et confocale à balayage laser (CLSM), la spectrométrie de masse avec désorption laser assistée par matrice- temps de vol (MALDI-TOF-MS), etc. Les essais appropriés ont été effectués pour valider la réussite de modification des microcapsules et pour confirmer à ce fait que la glucose oxydase est toujours active après chaque étape de modification. L’activité enzymatique spécifique de la glucose oxydase après l’encapsulation a été évaluée à 120±30 U/g. Aussi, des efforts ont été faits pour immobiliser la glucose oxydase sur des nanoparticules d’or avec deux tailles différentes de diamètre (10,9 nm et 50 nm) afin d’améliorer l’activité enzymatique et augmenter l’efficacité d’encapsulation. Les résultats obtenus lors de cette étude démontrent les modifications réussies sur les microcapsules d’alginate et aussi une réponse favorable de cette plate-forme antibactérienne concernant la désactivation de E. coli K-12. La concentration efficace de l’activité enzymatique afin de désactivation de cet agent pathogénique modèle a été déterminée à 1.3×10-2 U/ml pour une concentration de 6.7×108 cellules/ml de bactéries. D’autres études sont nécessaires pour évaluer l’efficacité de l’anticorps immobilisé dans la désactivation des agents pathogènes et également intégrer la plate-forme sur le papier et valider l’efficacité du système une fois qu’il est déposé sur papier.